TRANSFERENCIA Y
MANIPULACIÓN DE GENES
RECOMBINACIÓN
A nivel molecular se
han reconocido dos clases de recombinación genética
a) Recombinación
general.- Ocurre ampliamente en procariotas y eucariotas. Es el intercambio
genético entre secuencias homólogas de DNA en cromosomas separados. En este
proceso, el apareamiento de bases homólogas ocurre en una gran longitud de las
dos moléculas de DNA. De este modo se requieren secuencias idénticas o casi
idénticas en las dos moléculas recombinantes.
b) Recombinación
sitio-específica.- Difiere de la recombinación general en que no se requiere
homología en el DNA. En cambio, se reconocen secuencias específicas cortas de
nucleótidos por enzimas de recombinación. El proceso es llamado recombinación
sitio-específica porque la enzima de recombinación reconoce secuencias de
nucleótidos específicos (sitios) presente en una o ambas moléculas de DNA
recombinante. Es en esta secuencia en la que ocurre recombinación.
Ej. Bacteriófago
lambda (l),
transposones
EVENTOS MOLECULARES
EN
A nivel molecular, la
recombinación ha sido estudiada sólo en procariotas y virus. El proceso de
análisis ha sido muy complicado en eucariotas.
En bacterias, la
recombinación general involucra la participación de una proteína específica
llamada RecA, la cual es especificada por el gen recA.
RecA es una proteína
helicoidal que se enrolla alrededor de la hélice de DNA facilitando de este
modo la recombinación. Las bacterias que son mutantes en recA muestran niveles
marcadamente reducidos de recombinación general
è La recombinación general implica el apareamiento de
las moléculas de DNA en grandes extensiones.
MECANISMO GENERAL
1.- Mella (Nick), en
una de las hebras, origina la formación de un segmento corto monocatenario
2.- Unión de proteína
desestabilizante de la hélice, a la hebra monocatenaria, ayuda a la apertura de
la doble hélice de DNA
3.- Unión de la
proteína RecA, al segmento monocatenario y lo sitúa de modo que ocurra una reasociación con una secuencia complementaria en
el dúplex adyacente.
DETECCIÓN DE
Para detectar el
cambio físico de segmentos de DNA, las células resultantes de la recombinación
deben ser fenotípicamente diferentes de sus parentales.
Por lo común se debe usar como cepas receptoras, aquellas que tengan características seleccionables, como la incapacidad para crecer en un medio en el cual los recombinantes sí pueden crecer.
La transferencia de la información genética puede ocurrir de tres formas: Transformación, transducción y conjugación
Proceso por el que el
DNA libre es insertado directamente en una célula receptora competente
El DNA libre se
incorpora a la célula receptora y provoca un cambio genético
El descubrimiento de
la transformación genética en las bacterias fue uno de los acontecimientos
importantes en biología, dado que dio lugar a experimentos que probaron sin
lugar a dudas que el DNA era el material genético
Se ha encontrado que
varias bacterias son transformables, incluyendo especies Gram (-) y Gram (+).
Sólo ciertas cepas
denominadas competentes son transformables
Competencia.-Una célula capaz de adquirir una molécula de
DNA y transformarse se dice que es
competente.
Sólo ciertas cepas
son competentes; parece que esta capacidad es una propiedad heredada por el
organismo. En algunas bacterias la competencia está gobernada por proteínas
especiales que juegan un papel en la captación y procesamiento del DNA.
è Proteína
de fijación del DNA asociado a membrana, una autolisina de la pared celular y
varias nucleasas
INCREMENTO DE
Muchos organismos
sólo se transforman muy poco o no se transforman. Este fenómeno es más
eficiente en cepas que son deficientes de algunas DNAasas, las cuales
destruirán normalmente al DNA entrante
INTEGRACIÓN DEL DNA
INCORPORADO (Ver transparencia)
- Transformación con
participación de DNA viral en lugar de DNA de otra bacteria.
- Las bacterias se
pueden transformar con DNA extraído de un virus.
Métodos mecánicos:
- Electroporación.- Campos con
pulsos eléctricos en presencia DNA.
- Pistola de partículas
TRANSDUCCIÓN
El DNA es transferido
de una célula a otra mediante la participación de un virus.
Puede ser de dos
formas:
1.- Transducción especializada, sólo
en virus temperados, grupo específico de genes del hospedero es integrado al
genoma viral
2.- Transducción generalizada,
ocurre durante el ciclo lítico de un fago, puede transferir cualquier parte del
genoma bacteriano
PLÁSMIDOS
- Elementos genéticos
circulares que se reproducen en forma autónoma y tienen una existencia
extracromosómica.
- Muchos plásmidos se
pueden transferir de célula a célula por medio de la conjugación. Algunos
plásmidos también tienen la capacidad de integrarse a los cromosomas
- Los plásmidos
pueden contener una variedad de genes, por ejemplo,
$
Producción de toxinas
$
Resistencia a antibióticos
$
Resistencia a metales pesados
- Algunos plásmidos
llevan genes para el catabolismo de sustancias poco usuales, por ejemplo,
compuestos aromáticos, plaguicidas, etc.
- Muchos plásmidos
también llevan genes que controlan los procesos de conjugación:
$
genes que alteran la superficie de las células para
permitir el contacto de célula a célula;
$
genes que llevan a cabo la transferencia de DNA de una
célula a otra.
- Plásmidos
conjugativos Þ plásmidos
que gobiernan su propia transferencia
EVIDENCIA FÍSICA DE
LOS PLÁSMIDOS
ELIMINACIÓN DE LOS
PLÁSMIDOS
- Espontáneamente
- Acridina, bromuro
de etidio, inanición con timina, UV, ionizante, metales pesados, temperaturas
extremas
CLASES DE PLÁSMIDOS
1.- Pelos F e I
2.- Factores de
transferencia de resistencia (Factor R).- Confieren resistencia a antibióticos
y a varios inhibidores de crecimiento. Ej. Plásmido R100 es un plásmido de 90
pares de kilobases.
3.- Toxinas.- E.coli,
factor K (prot.)
4.- Bacteriocinas.-
Agentes que inhiben o matan especies estrechamente relacionadas. Compuestos por
proteínas. Colicina (Plásmido Col), subtilisina
INCOMPATIBILIDAD DE
PLÁSMIDOS
CONJUGACIÓN
La conjugación
bacteriana, o apareamiento, es un proceso de transferencia genética que supone
contacto de célula a célula.
El material genético
transferido puede ser un plásmido o una porción del cromosoma movilizada por un
plásmido.
La célula donadora
posee un plásmido conjugativo: pelo sexual
MECANISMOS DE
TRANSFERENCIA DE DNA
DURANTE
- Una de las cadenas
del DNA se deriva de la célula donadora y la otra es recién sintetizada en la
receptora durante los procesos de transferencia
- Círculo rodante
TRANSPOSONES Y
SECUENCIAS DE INSERCIÓN
Los genes de los
organismos vivos no son estáticos, sino que bajo ciertas condiciones son
capaces de cambiar de lugar
TRANSPOSICIÓN
Proceso mediante el
cual se mueve un gen de un lugar a otro en el genoma
En el más común de
los tipos, la transposición está ligada a la presencia de secuencias especiales
de bases que se llaman secuencias de inserción, que son segmentos cortos
específicos de DNA, que tienen la capacidad de desplazarse a otros sitios en el
genoma.
TRANSPOSONES
Son elementos
compuestos movibles que contienen secuencias de inserción apareadas que
colindan con otras regiones genéticas
Los elementos
transponibles más sencillos son las secuencias de inserción mismas que parecen
no tener otros genes que los capaces de lograr su propia transposición.
Secuencias de
inserción (IS).- Segmentos cortos de DNA de 1000 nucleótidos
Dos mecanismos de
transposición:
a) Conservador.- El
elemento transponible se sale de un lugar en el cromosoma y se reinserta en un
segundo lugar. El número de copias de un transposón conservador, por
consiguiente sigue siendo uno. Ej. Tn5
b) Replicador.- Se replican y el conjunto replicado se
inserta en otro lugar. Una copia del elemento de transposición permanece en el
sitio original y otra copia se encuentra en el nuevo sitio.
Ingeniería genética.-
Permite el
aislamiento y purificación de genes específicos
Aislamiento,
manipulación y expresión del material genético
Tener grandes
cantidades de DNA puro, permite la caracterización y manipulación de genes y
sus productos
Con los genes
clonados, podemos determinar la secuencia de nucleótidos de un gen, de lo cual
podemos derivar, a través del código genético, la secuencia de aminoácidos de
su producto proteínico.
La ingeniería
genética tiene aplicaciones tanto en la investigación básica como en la
aplicada
En la investigación
básica: se utilizan técnicas de ingeniería genética para estudiar los
mecanismos de replicación y la expresión de los genes, en los procariotas,
eucariotas y los virus
En la investigación
aplicada: la ingeniería genética permite el desarrollo de cultivos bacterianos
capaces de producir productos valiosos, por ejemplo, la insulina humana, la
hormona de crecimiento, el interferón, vacunas y enzimas.
CLONACIÓN DE GENES
- La clonación de
genes es la base de la mayor parte de los procedimientos de ingeniería
genética.
Objetivo de la
clonación de genes: Aislar grandes cantidades de genes específicos en forma
pura
Estrategia básica de
clonación de genes: Trasladar el gen deseado de un genoma complejo grande
a uno pequeño sencillo.
La clonación de genes
se puede dividir en varias etapas:
1.- Aislamiento y
fragmentación del DNA de una fuente.- este puede ser el DNA genómico total de
un organismo de interés, DNA sintetizado a partir de una matriz de RNA por la
transcriptasa inversa o también DNA sintetizado a partir de nucleótidos in
vitro.
Si el DNA genómico es
la fuente, generalmente se corta con enzimas de restricción para obtener una
mezcla de fragmentos.
2.- Unión a un vector
de clonación con DNA ligasa
Vector de clonación.- Pequeños
elementos genéticos que se replican en forma independiente y se usan para
replicar genes. Los vectores de clonación son diseñados para permitir la
integración de DNA extraño.
Si el DNA de la
fuente y el vector se cortan con la misma enzima de restricción, entonces la
unión puede ser mediada por reasociación de regiones de cadenas sencilla
llamadas “extremos pegajosos”.
Los extremos romos
generados por diferentes enzimas de restricción también se pueden unir usando
técnicas especiales…
3.- Incorporación al
huésped.- El DNA recombínante se puede introducir a u organismo huésped por
transformación el DNA o por infección con partículas fago hechas por
encapsidación in vitro
Biblioteca de DNA: La incorporación
del DNA huésped da lugar a una mezcla de clones que contienen el clon deseado
junto a cualesquiera de otros clones que fueron generados al unir el DNA de la
fuente al vector
4.- Detección y
purificación del clon deseado: (ver sección 8.6)
5.- Producción de un
gran número de células o de bacteriófagos que contienen el clon deseado para
aislar y estudiar el DNA clonado.
LOS PLÁSMIDOS COMO
VECTORES DE CLONACIÓN
Los plásmidos tienen
propiedades muy útiles como vectores de clonación:
1.- Tamaño pequeño,
que hacen al DNA más fácil de aislar y de manipular intacto
2.- DNA circular, que
hace al DNA más estable durante el aislamiento químico
3.- Origen de
replicación independiente, de modo que su replicación en la célula se efectúa
fuera del control celular directo.
4.- Puede estar presente
en la célula en varias o numerosas copias, haciendo posible la amplificación
del DNA.
5.- Frecuentemente,
tienen resistencia a los antibióticos, lo que hace más fácil la detección y la
selección de los clones que contienen el plásmido.
Control celular
relajado.- Se hace una gran cantidad de copias
Control estricto.- Se
hacen pocas copias
Es importante lograr
alta cantidad de copias
Un ejemplo de
plásmido adecuado para la clonación es el pBR322, que se replica en E. coli.
Características de
pBR322:
1.- Es relativamente
pequeño, 2.6x106
2.- Se mantiene
estable en su huésped (E. coli) en una cantidad relativamente alta de copias:
20-30 copias por célula
3.- Se puede
amplificar a una cantidad muy alta de copias (1000-3000 copias por célula; 40%
del genoma) por inhibición de la síntesis de proteínas por adición de
cloramfenicol.
4.- Es fácil de
aislar en forma superenrollada utilizando un gradiente de cloruro de
cesio/bromuro de etidio.
5.- Se puede insertar
una gran cantidad de DNA extraño; hasta 10 Kb.
6.- Se conoce la
secuencia completa de bases de este plásmido de 4363 nucleótidos de largo,
haciendo posible la ubicación de sitios donde pueden actuar las enzimas de
restricción
7.- Hay sitios únicos
de ruptura para varias enzimas de restricción como Pst1, SaII, EcoRI, HindIII,
BamHI y otros más
8.- Tiene dos
marcadores de resistencia a antibióticos, ampicilina y tetraciclina, lo cual
permite la fácil selección de los huéspedes que contienen el plásmido
9.- Se pueden usar
fácilmente en la transformación.
è Los plásmidos son los
mejores vectores de clonación si lo que se desea es la expresión del gen
clonado
LOS BACTERIÓFAGOS
COMO VECTORES DE CLONACIÓN
El bacteriófago
l, es un
vector de clonación útil debido a que su genética molecular es bien conocida ya
que el DNA puede empacarse muy efectivamente en las partículas del fago.
Fagos lambda
modificados
El fago lambda de
tipo salvaje no es muy apropiado como vector de clonación porque tiene
demasiados sitios de cortes de enzimas de restricción, lo cual hace difícil la
introducción de cortes únicos sencillos.
El fago lambda modificado, CARON, se han eliminado los sitios de corte de
la enzima de restricción (ER) no deseados por mutación puntual, omisión o
sustitución.
Etapas de la
clonación con lambda
1.- Aislamiento del
DNA vector a partir de partículas de fago y digestión con ER apropiada.
2.- Conexión de los
dos fragmentos lambda a fragmentos de DNA extraño usando DNA ligasa.
3.- Encapsidación del
DNA por adición de extractos celulares que contienen las proteínas de la cabeza
y de la cola y que permiten la formación de fagos viables
4.- Infección de E.
coli y asilamiento de los clones del fago, por formación de calvas en una cepa
del huésped
5.- Comprobación del
fago recombinante por la presencia de la secuencia deseada en el DNA extraño
mediante procedimientos de hibridación o de observación de las propiedades
genéticas.
La selección de los
recombinantes es un problema menor en lambda que con los plásmidos debido a
que:
1.- La eficiencia de
la transferencia del DNA recombinante en la célula por lambda es muy alta
2.- Los fragmentos
lambda que no han recibido nuevo DNA son muy pequeños para ser incorporados en
partículas de fagos.
Sin embargo, la
viabilidad de las partículas del fago es baja si el DNA es más largo del 105 %
del DNA normal de lambda, de tal modo que fragmentos realmente largos (más de
20000 bases) no pueden clonarse eficientemente.
è Entonces, cósmidos!
CÓSMIDOS
En su forma más
simple, vectores cósmidos son plásmidos modificados que llevan una copia de las
secuencias de DNA (secuencias cos) requeridos para el empaquetamiento del DNA
dentro del bacteriófago
Los vectores cósmidos
fueron diseñados para clonar y propagar grandes fragmentos de DNA genómico
Los cósmidos se
construyen a partir de plásmidos que contienen DNA clonado, ligando la región
cos de la lambda al DNA del plásmido
Ventajas:
- Se utiliza para
clonar segmentos muy grandes de DNA
- El DNA se puede
almacenar en el fago en lugar del plásmido. Los fagos son más estables que los
plásmidos, el DNA recombinante se puede almacenar por más tiempo
HUÉSPEDES PARA LOS
VECTORES DE CLONACIÓN
Características.-
a) Crecimiento rápido
b) Capacidad de
crecer en medios de cultivos baratos
c) No perjudicial ni
patógeno
d) Transformable por
DNA y estable en cultivos
Los huéspedes más
útiles para la clonación son microorganismos que crecen bien y para los que se
dispone de abundante información genética son: E. coli, B. subtilis,
S. cerevisiae.
ENCONTRANDO EL CLON
CORRECTO
DNA SINTÉTICO
El DNA se sintetiza
por un procedimiento en fase sólida en el cual el primer nucleótido de la
cadena se sujeta a un soporte poroso insoluble (Por ejemplo, gel de sílice, 50 mm de diámetro)
Se necesita varias
etapas químicas para la adición de cada uno de los nucleótidos. Una vez
completada cada etapa, la fase sólida que contiene el oligonucleótido en crecimiento
se elimina de la mezcla de reacción por filtración o por centrifugación
Las moléculas de DNA
sintético son muy usadas como sondas en ingeniería genética, para detectar vía
hibridación de ácido nucleico, las secuencias específicas de DNA
AMPLIFICACIÓN DEL
DNA: Reacción en cadena de la polimerasa
Requiere el
conocimiento de la secuencia de nucleótidos de una porción del gen deseado
CLONACIÓN Y EXPRESIÓN
DE GENES DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS
a) Encontrando el gen
vía RNAm
b) Lograr un gen vía
proteína.- Traducción inversa, precipitación de polirribosomas
c) Síntesis del gen
completo
EXPRESIÓN DE GENES DE
MAMÍFEROS EN BACTERIAS
Para que los genes
clonados de mamíferos sean expresados en una bacteria es esencial que el gen
del mamífero sea insertado junto a promotor, y que esté presente un sitio de
unión del ribosoma, también es esencial que el marco de lectura sea la
correcta.
Mutagénesis sitio
dirigida (Fig. 8.13)
RESULTADOS PRÁCTICOS
DE
1.- fermentaciones
microbianas, producción de antibióticos
2.- Vacunas víricas
3.- Proteínas de
mamíferos
4.- Plantas y
animales transgénicos
5.- Biotecnología
ambiental
Resumen de los
fundamentos en la que se apoya la ingeniería genética
Los siguientes
avances fueron esenciales para el perfeccionamiento de la ingeniería genética
1.- Química del DNA
2.- Enzimología del
DNA
3.- Replicación del
DNA
4.- Plásmidos
5.- Bacteriófagos
temperados
6.- Transformación
7.- RNA: química y
enzimología
8.- Transcripción
inversa
9.- Regulación
10.- Traducción
11.- Química de las
proteínas
12.- Excreción de
proteína y modificación post traduccional
13.- Código genético