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Transferencia y manipulación de genes


RECOMBINACIÓN
A nivel molecular se han reconocido dos clases de recombinación genética:

a) Recombinación general.- Ocurre ampliamente en procariotas y eucariotas. Es el intercambio genético entre secuencias homólogas de DNA en cromosomas separados. En este proceso, el apareamiento de bases homólogas ocurre en una gran longitud de las dos moléculas de DNA. De este modo se requieren secuencias idénticas o casi idénticas en las dos moléculas recombinantes.
b) Recombinación sitio-específica.- Difiere de la recombinación general en que no se requiere homología en el DNA. En cambio, se reconocen secuencias específicas cortas de nucleótidos por enzimas de recombinación. El proceso es llamado recombinación sitio-específica porque la enzima de recombinación reconoce secuencias de nucleótidos específicos (sitios) presente en una o ambas moléculas de DNA recombinante. Es en esta secuencia en la que ocurre recombinación.
Ej. Bacteriófago lambda (λ), transposones

EVENTOS MOLECULARES EN LA RECOMBINACIÓN GENERAL
A nivel molecular, la recombinación ha sido estudiada sólo en procariotas y virus. El proceso de análisis ha sido muy complicado en eucariotas.En bacterias, la recombinación general involucra la participación de una proteína específica llamada RecA, la cual es especificada por el gen recA. RecA es una proteína helicoidal que se enrolla alrededor de la hélice de DNA facilitando de este modo la recombinación. Las bacterias que son mutantes en recA muestran niveles marcadamente reducidos de recombinación general

⇒ La recombinación general implica el apareamiento de las moléculas de DNA en grandes extensiones.

MECANISMO GENERAL
1.- Mella (Nick), en una de las hebras, origina la formación de un segmento corto monocatenario
2.- Unión de proteína desestabilizante de la hélice, a la hebra monocatenaria, ayuda a la apertura de la doble hélice de DNA
3.- Unión de la proteína RecA, al segmento monocatenario y lo sitúa de modo que ocurra una reasociación con una secuencia complementaria en el dúplex adyacente.

DETECCIÓN DE LA RECOMBINACIÓN
Para detectar el cambio físico de segmentos de DNA, las células resultantes de la recombinación deben ser fenotípicamente diferentes de sus parentales.
Por lo común se debe usar como cepas receptoras, aquellas que tengan características seleccionables, como la incapacidad para crecer en un medio en el cual los recombinantes sí pueden crecer.

La transferencia de la información genética puede ocurrir de tres formas: Transformación, transducción y conjugación

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Proceso por el que el DNA libre es insertado directamente en una célula receptora competente
El DNA libre se incorpora a la célula receptora y provoca un cambio genético
El descubrimiento de la transformación genética en las bacterias fue uno de los acontecimientos importantes en biología, dado que dio lugar a experimentos que probaron sin lugar a dudas que el DNA era el material genético.
Se ha encontrado que varias bacterias son transformables, incluyendo especies Gram (-) y Gram (+).
Sólo ciertas cepas denominadas competentes son transformables

Competencia.-Una célula capaz de adquirir una molécula de DNA y transformarse se dice que es competente. Sólo ciertas cepas son competentes; parece que esta capacidad es una propiedad heredada por el organismo. En algunas bacterias la competencia está gobernada por proteínas especiales que juegan un papel en la captación y procesamiento del DNA.

⇒ Proteína de fijación del DNA asociado a membrana, una autolisina de la pared celular y varias nucleasas

INCREMENTO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Muchos organismos sólo se transforman muy poco o no se transforman. Este fenómeno es más eficiente en cepas que son deficientes de algunas DNAasas, las cuales destruirán normalmente al DNA entrante

INTEGRACIÓN DEL DNA INCORPORADO

TRANSFECCIÓN.-
- Transformación con participación de DNA viral en lugar de DNA de otra bacteria.
- Las bacterias se pueden transformar con DNA extraído de un virus.

Métodos mecánicos:

TRANSDUCCIÓN
El DNA es transferido de una célula a otra mediante la participación de un virus.
Puede ser de dos formas:

  1. Transducción especializada, sólo en virus temperados, grupo específico de genes del hospedero es integrado al genoma viral
  2. Transducción generalizada, ocurre durante el ciclo lítico de un fago, puede transferir cualquier parte del genoma bacteriano

PLÁSMIDOS


Los plásmidos pueden contener una variedad de genes, por ejemplo,
♦ Producción de toxinas
♦ Resistencia a antibióticos
♦ Resistencia a metales pesados
- Algunos plásmidos llevan genes para el catabolismo de sustancias poco usuales, por ejemplo, compuestos aromáticos, plaguicidas, etc.
- Muchos plásmidos también llevan genes que controlan los procesos de conjugación:
- Plásmidos conjugativos ⇒ plásmidos que gobiernan su propia transferencia

EVIDENCIA FÍSICA DE LOS PLÁSMIDOS

ELIMINACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS
- Espontáneamente
- Acridina, bromuro de etidio, inanición con timina, UV, ionizante, metales pesados, temperaturas extremas

CLASES DE PLÁSMIDOS

INCOMPATIBILIDAD DE PLÁSMIDOS

CONJUGACIÓN
La conjugación bacteriana, o apareamiento, es un proceso de transferencia genética que supone contacto de célula a célula.
El material genético transferido puede ser un plásmido o una porción del cromosoma movilizada por un plásmido.
La célula donadora posee un plásmido conjugativo: pelo sexual

MECANISMOS DE TRANSFERENCIA DE DNA DURANTE LA CONJUGACIÓN
- Una de las cadenas del DNA se deriva de la célula donadora y la otra es recién sintetizada en la receptora durante los procesos de transferencia
- Círculo rodante

TRANSPOSONES Y SECUENCIAS DE INSERCIÓN
Los genes de los organismos vivos no son estáticos, sino que bajo ciertas condiciones son capaces de cambiar de lugar

TRANSPOSICIÓN
Proceso mediante el cual se mueve un gen de un lugar a otro en el genoma
En el más común de los tipos, la transposición está ligada a la presencia de secuencias especiales de bases que se llaman secuencias de inserción,que son segmentos cortos específicos de DNA, que tienen la capacidad de desplazarse a otros sitios en el genoma.

TRANSPOSONES
Son elementos compuestos movibles que contienen secuencias de inserción apareadas que colindan con otras regiones genéticas
Los elementos transponibles más sencillos son las secuencias de inserción mismas que parecen no tener otros genes que los capaces de lograr su propia transposición.

Secuencias de inserción (IS).- Segmentos cortos de DNA de 1000 nucleótidos

Mecanismo de transposición
Dos mecanismos de transposición:

  1. Conservador.- El elemento transponible se sale de un lugar en el cromosoma y se reinserta en un segundo lugar. El número de copias de un transposón conservador, por consiguiente sigue siendo uno. Ej. Tn5
  2. Replicador.- Se replican y el conjunto replicado se inserta en otro lugar. Una copia del elemento de transposición permanece en el sitio original y otra copia se encuentra en el nuevo sitio.

MANIPULACIÓN DE GENES E INGENIERÍA GENÉTICA

Ingeniería genética.-


Permite el aislamiento y purificación de genes específicos
Aislamiento, manipulación y expresión del material genético
Tener grandes cantidades de DNA puro, permite la caracterización y manipulación de genes y sus productos
Con los genes clonados, podemos determinar la secuencia de nucleótidos de un gen, de lo cual podemos derivar, a través del código genético, la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico.
La ingeniería genética tiene aplicaciones tanto en la investigación básica como en la aplicada
En la investigación básica: se utilizan técnicas de ingeniería genética para estudiar los mecanismos de replicación y la expresión de los genes, en los procariotas, eucariotas y los virus
En la investigación aplicada: la ingeniería genética permite el desarrollo de cultivos bacterianos capaces de producir productos valiosos, por ejemplo, la insulina humana, la hormona de crecimiento, el interferón, vacunas y enzimas.

CLONACIÓN DE GENES
- La clonación de genes es la base de la mayor parte de los procedimientos de ingeniería genética.
Objetivo de la clonación de genes: Aislar grandes cantidades de genes específicos en forma pura
Estrategia básica de clonación de genes: Trasladar el gen deseado de un genoma complejo grande a uno pequeño sencillo. La clonación de genes se puede dividir en varias etapas:

  1. Aislamiento y fragmentación del DNA de una fuente.- este puede ser el DNA genómico total de un organismo de interés, DNA sintetizado a partir de una matriz de RNA por la transcriptasa inversa o también DNA sintetizado a partir de nucleótidos in vitro. Si el DNA genómico es la fuente, generalmente se corta con enzimas de restricción para obtener una mezcla de fragmentos.
  2. Unión a un vector de clonación con DNA ligasa

    Vector de clonación.- Pequeños elementos genéticos que se replican en forma independiente y se usan para replicar genes. Los vectores de clonación son diseñados para permitir la integración de DNA extraño. Si el DNA de la fuente y el vector se cortan con la misma enzima de restricción, entonces la unión puede ser mediada por reasociación de regiones de cadenas sencilla llamadas “extremos pegajosos”. Los extremos romos generados por diferentes enzimas de restricción también se pueden unir usando técnicas especiales…

  3. Incorporación al huésped.- El DNA recombínante se puede introducir a u organismo huésped por transformación el DNA o por infección con partículas fago hechas por encapsidación in vitro
    Biblioteca de DNA: La incorporación del DNA huésped da lugar a una mezcla de clones que contienen el clon deseado junto a cualesquiera de otros clones que fueron generados al unir el DNA de la fuente al vector
  4. Detección y purificación del clon deseado: (ver sección 8.6)
  5. Producción de un gran número de células o de bacteriófagos que contienen el clon deseado para aislar y estudiar el DNA clonado.

LOS PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONACIÓN
Los plásmidos tienen propiedades muy útiles como vectores de clonación:

  1. Tamaño pequeño, que hacen al DNA más fácil de aislar y de manipular intacto
  2. DNA circular, que hace al DNA más estable durante el aislamiento químico
  3. Origen de replicación independiente, de modo que su replicación en la célula se efectúa fuera del control celular directo.
  4. Puede estar presente en la célula en varias o numerosas copias, haciendo posible la amplificación del DNA.
  5. Frecuentemente, tienen resistencia a los antibióticos, lo que hace más fácil la detección y la selección de los clones que contienen el plásmido.

Un ejemplo de plásmido adecuado para la clonación es el pBR322, que se replica en E. coli.
Características de pBR322:

  1. Es relativamente pequeño, 2.6x106
  2. Se mantiene estable en su huésped (E. coli) en una cantidad relativamente alta de copias: 20-30 copias por célula
  3. Se puede amplificar a una cantidad muy alta de copias (1000-3000 copias por célula; 40% del genoma) por inhibición de la síntesis de proteínas por adición de cloramfenicol.
  4. Es fácil de aislar en forma superenrollada utilizando un gradiente de cloruro de cesio/bromuro de etidio.
  5. Se puede insertar una gran cantidad de DNA extraño; hasta 10 Kb.
  6. Se conoce la secuencia completa de bases de este plásmido de 4363 nucleótidos de largo, haciendo posible la ubicación de sitios donde pueden actuar las enzimas de restricción
  7. Hay sitios únicos de ruptura para varias enzimas de restricción como Pst1, SaII, EcoRI, HindIII, BamHI y otros más
  8. Tiene dos marcadores de resistencia a antibióticos, ampicilina y tetraciclina, lo cual permite la fácil selección de los huéspedes que contienen el plásmido
  9. Se pueden usar fácilmente en la transformación.

LOS BACTERIÓFAGOS COMO VECTORES DE CLONACIÓN

El bacteriófago λ, es un vector de clonación útil debido a que su genética molecular es bien conocida ya que el DNA puede empacarse muy efectivamente en las partículas del fago.
Fagos lambda modificados
El fago lambda de tipo salvaje no es muy apropiado como vector de clonación porque tiene demasiados sitios de cortes de enzimas de restricción, lo cual hace difícil la introducción de cortes únicos sencillos. El fago lambda modificado, CARON, se han eliminado los sitios de corte de la enzima de restricción (ER) no deseados por mutación puntual, omisión o sustitución.
Etapas de la clonación con lambda

  1. Aislamiento del DNA vector a partir de partículas de fago y digestión con ER apropiada.
  2. Conexión de los dos fragmentos lambda a fragmentos de DNA extraño usando DNA ligasa.
  3. Encapsidación del DNA por adición de extractos celulares que contienen las proteínas de la cabeza y de la cola y que permiten la formación de fagos viables
  4. Infección de E. coli y asilamiento de los clones del fago, por formación de calvas en una cepa del huésped
  5. Comprobación del fago recombinante por la presencia de la secuencia deseada en el DNA extraño mediante procedimientos de hibridación o de observación de las propiedades genéticas.

La selección de los recombinantes es un problema menor en lambda que con los plásmidos debido a que:
  1. La eficiencia de la transferencia del DNA recombinante en la célula por lambda es muy alta
  2. Los fragmentos lambda que no han recibido nuevo DNA son muy pequeños para ser incorporados en partículas de fagos.

Sin embargo, la viabilidad de las partículas del fago es baja si el DNA es más largo del 105 % del DNA normal de lambda, de tal modo que fragmentos realmente largos (más de 20000 bases) no pueden clonarse eficientemente.

⇒ Entonces, cósmidos!

CÓSMIDOS
En su forma más simple, vectores cósmidos son plásmidos modificados que llevan una copia de las secuencias de DNA (secuencias cos) requeridos para el empaquetamiento del DNA dentro del bacteriófago
Los vectores cósmidos fueron diseñados para clonar y propagar grandes fragmentos de DNA genómico
Los cósmidos se construyen a partir de plásmidos que contienen DNA clonado, ligando la región cos de la lambda al DNA del plásmido
Ventajas:
- Se utiliza para clonar segmentos muy grandes de DNA
- El DNA se puede almacenar en el fago en lugar del plásmido. Los fagos son más estables que los plásmidos, el DNA recombinante se puede almacenar por más tiempo

HUÉSPEDES PARA LOS VECTORES DE CLONACIÓN

Características.-


Los huéspedes más útiles para la clonación son microorganismos que crecen bien y para los que se dispone de abundante información genética son: E.coli, B. subtilis, S. cerevisiae.

ENCONTRANDO EL CLON CORRECTO

DNA SINTÉTICO El DNA se sintetiza por un procedimiento en fase sólida en el cual el primer nucleótido de la cadena se sujeta a un soporte poroso insoluble (Por ejemplo, gel de sílice, 50 ?m de diámetro)
Se necesita varias etapas químicas para la adición de cada uno de los nucleótidos. Una vez completada cada etapa, la fase sólida que contiene el oligonucleótido en crecimiento se elimina de la mezcla de reacción por filtración o por centrifugación
Las moléculas de DNA sintético son muy usadas como sondas en ingeniería genética, para detectar vía hibridación de ácido nucleico, las secuencias específicas de DNA

AMPLIFICACIÓN DEL DNA: Reacción en cadena de la polimerasa
Requiere el conocimiento de la secuencia de nucleótidos de una porción del gen deseado

CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE GENES DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS

EXPRESIÓN DE GENES DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS
Para que los genes clonados de mamíferos sean expresados en una bacteria es esencial que el gen del mamífero sea insertado junto a promotor, y que esté presente un sitio de unión del ribosoma, también es esencial que el marco de lectura sea la correcta.

Mutagénesis sitio dirigida (Fig. 8.13)

RESULTADOS PRÁCTICOS DE LA INGENIERÍA GENÉTICA

  1. fermentaciones microbianas, producción de antibióticos
  2. Vacunas víricas
  3. Proteínas de mamíferos
  4. Plantas y animales transgénicos
  5. Biotecnología ambiental

Resumen de los fundamentos en la que se apoya la ingeniería genética
Los siguientes avances fueron esenciales para el perfeccionamiento de la ingeniería genética

  1. Química del DNA
  2. Enzimología del DNA
  3. Replicación del DNA
  4. Plásmidos
  5. Bacteriófagos temperados
  6. Transformación
  7. RNA: química y enzimología
  8. Transcripción inversa
  9. Regulación
  10. Traducción
  11. Química de las proteínas
  12. Excreción de proteína y modificación post traduccional
  13. Código genético